痴呆和阿尔茨海默病
痴呆（Dementia）的种类很多，除了阿尔茨海默症（Alzheimerdisease，AD，也叫老年痴呆）以外，还有血管性痴呆（Vasculardementia），额颞叶痴呆（Frontotemporaldementia）和路易小体痴呆（DementiawithLewybodies）等。其他疾病如亨廷顿综合征（Huntingtondisease）或帕金森综合症（Parkinsondisease）也伴有痴呆症状产生。不过，AD是所有痴呆中占比最大的，达到6到7成。接下来就是血管性痴呆和额颞页痴呆，分别占比约为10-20%和10%，剩下的痴呆类型相对较少。不仅在痴呆中占有最大的比例，AD也是神经退行性疾病中占比最多的，甚至超过了其余神经退行性疾病病患数量的总和。
从症状上看，AD会影响病患的空间记忆，具体表现为在熟悉的地方会迷路；其次会频繁忘记刚刚做过的事情，比如忘记自己吃过午饭；还有就是对于以往非常熟练的技能会变得很生疏；逐渐忘记朋友甚至亲人的名字；时间概念混乱。到后期还会逐渐出现情绪暴躁、回避社交行为以及语言功能障碍等问题，最后生活不能自理直至各种器官衰竭而死去。
图1.阿尔茨海默症症状及其在痴呆中的比例[1,2]
阿尔茨海默症负担沉重但科研投入不足
这样严重的疾病常常被我们当做是“老糊涂”了，在症状初期没有给予足够的重视，任其发展到晚期时已无可挽回。据美国国立卫生研究院（NIH）年的统计，该年美国投入在癌症研发上的经费为50亿美元，而投入在阿尔茨海默病上的只有5亿美元；但是，美国全社会却承担着由阿尔茨海默症带来的亿美元的沉重负担，而所有癌症造成的负担加起来只有AD的一半；另一方面美国每年因阿尔茨海默病死亡的人数与罹患癌症而死的人数几乎相等。阿尔茨海默病之所以造成如此之重的经济负担，除了对病患的治疗费用以外，更大的花费在对于患者的看护上，而且AD发病后相对癌症而言持续时间长，需要占用看护者的大量时间和精力，并剥夺了其创造社会价值的机会成本。
图2.年美国阿尔茨海默病与癌症研发投入对比[3]
阿尔茨海默症假说及药物研发现状
随着多年来对AD研究的深入，我们已经了解到AD有两大病例特征，即患者脑中会存在大量由Aβ（AmyloidBeta）聚集而成的淀粉样沉淀和由tau聚集而成的神经纤维缠结，其中Aβ由APP（AmyloidPrecursorProtein）经过两次剪切而成（BACE1剪第一刀，含有PS1/2的γ剪切酶负责补上一刀），tau蛋白则由MAPT（微管结合蛋白tau）基因编码而来，并被过度磷酸化而聚集成纤维缠结。虽然现在我们投入巨大精力研究了APP，Aβ，BACE1（β-Secretase），PS1（γ-Secretase的组成部分）以及tau，并以这些蛋白作为靶点开发药物，但这些药物在最终临床阶段几乎全部折戟沉沙。目前获批的药物仅仅是三种乙酰胆碱酶抑制剂和一种NMDA受体（一种介导神经兴奋性的受体）的抑制剂以及和肠道菌群相关的GV，而且GV目前机理不明确且没有获得广泛使用，而前面几种只能暂时缓解AD症状，并不能起到治疗AD的作用，甚至连延缓病程也无法做到。
所以几十年的研究中人们虽然对AD的认识在不断深化，但在治疗上并不像肿瘤和艾滋病以及传染性疾病上那样有实质性的突破。在临床、动物、细胞等实验中各种不一致的现象让AD的机理更加扑朔迷离。另外值得注意的是，在临床前的模式动物研究中，主要的基因编辑对象是Aβ源头蛋白APP，以及γ剪切酶中的PS1以及β剪切酶（BACE1），其中前两种基因的一些突变会造成AD发病程度的加重和发病时间的提前。我们把这两种基因突变造成的AD称为早发型AD。但这种遗传性AD病例在所有的患者中只占不到5%的比例。真实情况是大部分病例是散发性的，即发病时间一般在65岁之后，并且也没有APP和PS1的突变。而临床实验中面对的大部分病例属于散发型，这或许是在模式动物中形势喜人的药物进入临床后期后，效果令人失望的原因。
而另一个AD中形成神经纤维缠结的tau蛋白编码基因MAPT，其突变并不会直接造成Aβ的聚集，也不会产生淀粉样沉淀。MAPT的突变是额颞叶痴呆的主要诱因之一，但AD却几乎与这种突变无关。AD病患脑中的tau聚集目前主流认为是Aβ或者炎症引起的。针对该蛋白，虽然人们制作了很多基因编辑小鼠进行临床前研究，也的确提升了我们对AD的了解，但针对tau作为靶点的药物目前暂无令人振奋的结果。
图3.阿尔茨海默症的Aβ假说[4]
APOE基因
有鉴于前文所述对AD不太成功的药物研发经历，我们能否暂时跳出思维定式，将目光转向其他的研究方向呢？
早在年，人们就已经发现了一种叫做APOE的载脂蛋白，随后的研究又发现这个蛋白与占AD病例95%的散发性AD有显著的联系。人类APOE基因位于第19号染色体上，编码一个个氨基酸的APOE蛋白。
该蛋白在人群中主要有三种，即APOE2，APOE3和APOE4。它们的区别在于APOE基因水平上两个位点的改变，反应到蛋白层面就是这两个位点（第个氨基酸和第个氨基酸）究竟是半胱氨酸（Cys）还是精氨酸（Arg）：
●如果一条染色体上编码得到的APOE两个位点都是Cys，这条染色体就是APOE2型；
●如果第号位是Cys，而第号位是Arg，那么这个载脂蛋白就是APOE3；
●如果两个都是Arg，那就是APOE4。
由于我们都有两条染色体，一条来自老爸，一条来自老妈，在形成受精卵时你便有可能得到APOE的6种组合（E2/E2，E2/E3，E3/E3，E3/E4，E2/E4及E4/E4）。
注：这里有同学可能要问为什么没有1型，答案是有的。其实还有5型，只不过这两种在人群中出现的概率极低（加起来不到0.1%，而且其变化依据是其他位点的氨基酸）。此外还有一种被命名为APOE3r的蛋白，该蛋白与APOE3正好相反，位为Arg，位为Cys，这种出现的概率也很低，因此我们在接下来的内容中会重点讲述在人群中分布最广的2/3/4型APOE。
图4.人类APOE基因多态性[5]
人类APOE多态性影响AD发病率
在一项研究大样本的研究中，通过检测正常人群和轻度认知障碍人群中淀粉样沉淀和APOE基因型之间的关系发现，无论是在哪种人群中，淀粉样蛋白沉淀随年龄增加的速度是APOE4APOE3APOE2。值得注意的是，APOE2的纯合人群中，其淀粉样蛋白的聚集几乎没有随年龄增长而增加。
我们把分布最广的APOE3纯合人群的AD发病率作为基准，含有APOE4人群的AD发病率都是高于APOE3纯合人群的，两种杂合含APOE4的人群阿尔茨海默病的患病概率分别是APOE3纯合的2.6和3.6倍；而纯合的APOE4的AD发病率则猛增到15.5倍。但两种APOE2基因型的人群中AD发病率几乎只有APOE3的一半。这项研究说明，APOE4基因只要存在就会提高AD发病的概率，而APOE2能在一定程度上阻止AD的发生。
图5.APOE多态性对AD发病率的影响[6]
APOE4对阿尔茨海默症发病机理的影响
（Aβ假说层面）
根据尸体解剖研究发现，APOE4在AD病患的脑中与神经元内的Aβ结合并聚集，从而形成淀粉样蛋白沉淀，并且与Aβ寡聚体（有研究表明寡聚体的毒性高于淀粉样沉淀）的数量正相关。首先我们要知道，三种APOE都能与Aβ直接结合，进而影响Aβ的清理和聚集。不过Aβ和APOE4的关系尤为亲密，二者亲和力最高。在各种APOE过表达的小鼠中，研究人员发现转入APOE4基因的小鼠脑脊液中，Aβ含量是APOE2或者APOE3的2~4倍。另一项研究也发现星型细胞（Astrocyte）中APOE4的过量表达会引起细胞外Aβ的聚集，但这种现象在另两种APOE小鼠中没有发生。向人源化的几种APOE小鼠脑中注射Aβ，会加剧hAPOE4小鼠的淀粉样蛋白聚集，而hAPOE3小鼠则不受影响。
除了加剧Aβ的聚集外，APOE4也会抑制Aβ的清理，这一方面是由于APOE4与Aβ结合，导致部分蛋白降解通路成员无法顺利结合Aβ，另一方面APOE4还会与Aβ竞争LRP1介导的细胞吸收作用，导致Aβ无法被及时清除，因此加剧了Aβ的聚集并损伤了相应APOE敲入小鼠的神经系统功能。Aβ的清理需要通过血脑屏障（blood–brainbarrier，BBB）进入血管，让Aβ被血液带走。有研究表明APOE2/3-Aβ复合物是通过VLDLR和LRP1两种受体穿过BBB的，而到了APOE4-Aβ复合物，就只能通过VLDLR了。要知道，VLDLR介导的APOE-Aβ内吞效率远低于LRP1，因此，APOE4占主导的话，Aβ的清理就会被延误。Neprilysin和IDE（insulin-degradingenzyme）是两种负责Aβ清理酶的重要蛋白水解酶，携带APOE4基因的病患海马中，这两种酶的含量要大大低于非APOE4携带者。
图6.APOE4对阿尔茨海默症发病机理的影响[6]
APOE4对阿尔茨海默症发病机理的影响
（非Aβ假说层面）
在Aβ之外，也有研究发现携带纯合APOE4的人要比杂合子人群大脑中含有更多的tau聚集，在小鼠神经元中特异性过表达APOE4会提高tau的磷酸化水平。通过将tau突变小鼠（PS）与不同人源化APOE小鼠进行杂交，在得到的三种APOE-tau小鼠中，发现在动物饲养到9月龄时，APOE4-tau小鼠表现出明显的大脑萎缩和神经炎症。
在突触可塑性方面，APOE4也会减少树突密度，并通过减少突触谷氨酸受体影响突触可塑性。尸检中也发现一系列突触标志物（如PSD95，Synaptophysin，Syntaxin1等）都在APOE4携带者中明显下降。动物方面，人源化APOE4小鼠比起APOE3小鼠及未经人源化的野生型小鼠而言，突触标志物蛋白表达、树突棘的密度和长度，突触传递效率都下降显著。
体外培养的人类神经干细胞中，三种APOE的酯化能力（结合脂类物质的量）由大到小依次为APOE2，APOE3，APOE4。胆固醇从细胞内向脑脊液中运输的能力也是APOE4最低。这种不同APOE载脂能力的差异在人源化APOE的小鼠中也得到了证实。
人们发现在AD发病前的很多年，这些人大脑中的糖代谢能力就已经开始减弱。胰岛素、胰岛素受体、胰岛素信号通路也在AD病患中受到损伤并影响到其认知能力。大量研究已经发现APOE4携带者，会增加患糖尿病和胰岛素抵抗等AD风险。上述这些临床结果与人源化APOE4小鼠中进行的实验结果一致，并且更进一步发现了这种对糖代谢的影响是通过下调PPARγ的表达及其信号通路实现的。在高脂食物饲养的情况下，APOE4小鼠比APOE3的糖分吸收能力低，同时也产生了胰岛素抵抗以及认知功能的损伤。小鼠在年轻时（3月龄）吃高脂食物并不会因为APOE的不同而影响胰岛素信号通路，但在22月龄时APOE基因型的不同就会造成糖代谢功能的明显差异。
此外APOE也在炎症反应、神经损伤修复、α-Synuclein（PD致病蛋白）调节等多方面对AD产生影响。
一系列的研究表明，与分布最为广泛的APOE3相比，APOE4等位基因会通过各种手段增加患上AD的风险，不论是在临床相关性的观察，还是在动物或者细胞实验中的因果关系验证上都为我们以APOE4作为靶点对抗AD打下了坚实的基础。
图7.APOE4影响AD发病的可能途径[6]
未来APOE模式动物的应用
APOE调节胆固醇运输和脂类代谢，Apoe敲除小鼠也是研究这类相关疾病的理想实验动物，在Apoe敲除小鼠中会有自发的动脉粥样硬化症状产生。如果我们把APOE3的功能作为基准，除了前文叙述过的不同APOE间的区别外：
●APOE2和APOE4与血浆甘油三酯的结合能力都要高于APOE3；
●与血浆胆固醇的结合能力则是按APOE2，APOE3，APOE4的顺序逐渐递增；
●蛋白稳定性按APOE2，APOE3，APOE4的顺序依次降低；
●APOE2与LDLR的亲和力远低于APOE3和APOE4；脂类结合能力上APOE4最强，同时其也是与VLDL亲和力最高的APOE蛋白，另外两种倾向于结合HDL。
在疾病方面，仍然将APOE3作为野生型看待，那么APOE2和APOE4都有3型高胆固醇血症的可能；不同的是，APOE2更有可能诱发外周血管疾病和动脉粥样硬化心血管疾病，而APOE4则更容易诱发心血管疾病和阿尔茨海默症（图8）。
当然，APOE的本职工作其实就是在中枢或者外周负责胆固醇以及其他脂类的调度运输。目前总体而言，APOE在外周的功能其实研究得比中枢更加深入。不同的APOE虽然至多只有两个氨基酸的差异，但是这种差异却造成了结构上的改变，以至于不同APOE与其受体的结合能力产生了很大的差异，进而影响不同人群中和脂类相关的生理和病理过程。举例说来，APOE2与LDLR受体的结合能力不到APOE3和APOE4与LDLR结合能力的1/50。因此，在外周，APOE2会造成富含甘油酸三酯的脂蛋白残余聚集成颗粒，进而引起三型高脂蛋白血症。另一个例子就是关于APOE4的了，APOE4更容易与VLDL形成颗粒，妨碍脂肪在外周组织中的分解，从而产生动脉粥样硬化的潜在危险。
图8.三种APOE蛋白的主要差异总结[7]
小鼠本身只有一种APOE，而人类中的APOE则有三种主要形式。要透彻研究APOE的功能，就需要将人类的三种APOE在小鼠中表达。在以前的很多研究中，通常是构建APOE过表达的转基因小鼠进行实验。把这些小鼠和传统的AD基因编辑小鼠杂交后的确也能产生反映APOE多态性与AD关联的表型，但过表达并非理想的基因编辑方式，一方面是因为过表达量使蛋白丰度有违生理状态，另一方面则是目的基因的随机插入有可能破坏原有基因功能，对目的表型产生干扰。因此，在不改变小鼠原有APOE启动子的情况下，将人的APOE蛋白（hAPOEs）替换原有的小鼠APOE进行的研究会更有意义，也更易将实验结果向临床转化。而且从结果上来看，hAPOE4小鼠也产生了认知障碍和神经突触的损伤。并且在与引入了hAPP突变的小鼠杂交后，hAPOE4-hAPP小鼠也能产生淀粉样沉淀，并且hAPOE4-hAPP小鼠产生的Aβ沉淀的量要高于hAPOE3-hAPP小鼠。
图9.APOE敲除及人源化小鼠主要应用领域
关于APOE多态性与疾病的很多研究都是在临床上先观察现象，统计规律，提出假说，然后再利用人源化的APOE小鼠进行实验，对因果关系进行验证。利用APOE小鼠，我们可以对脂类代谢、神经系统及免疫系统中APOE作用的机理进行研究，也可以与很多疾病固有的模型小鼠进行杂交，寻找APOE与疾病固有的信号通路之间有着怎样的相互作用关系。因此，在对疾病病理的探索和相应靶点的发现上，APOE基因编辑小鼠都将成为研究者们手中不可或缺的利器。
参考文献及引用图片来源：
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